"Hoge druk vloeistofchromatografie" zei men vroeger. Later is er "hoge prestatie vloeistofchromatografie" van gemaakt. HPLC lijkt op GC maar dan met vloeistof in plaats van gas. Stoffen die niet vluchtig te maken zijn, meestal omdat zij eerder ontleden dan verdampen, die kun je dus chromatograferen met HPLC. Het is ook goed te vergelijken met vloeistofchromatografie in een verticale glazen buis. Alleen hebben we de zwaartekracht vervangen door een sterke pomp. En de stationaire fase bestaat uit heel kleine korreltjes (0,003 - 0,010 mm). Deze kleine korreltjes vormen een zo dichte pakking dat de extra sterke pomp nodig is.
Uit welke onderdelen bestaat het HPLC-instrument? Bekijk de video.
Bij HPLC vind je meer scheidingsprincipes dan bij GC/GLC. Molecuulgrootte en ionenwisseling zijn hier ook belangrijk.
Adsorptie
Langskomende moleculen worden aan het oppervlak geadsorbeerd.
Verdeling
Moleculen lossen op in de stationaire fase. Er stelt zich een evenwicht in tussen de concentratie in de stationaire en die in de mobiele fase.
Uitsluiting (exclusie)
Kleine moleculen worden tegengehouden door de holtes in de stationaire fase. Grote moleculen gaan ongehinderd door.
Ionenwisseling
Scheiding door lading: negatieve ionen houden de positieve vast en natuurlijk omgekeerd. Hoe hoger de lading des te sterker de remming.
Affiniteit
Stereospecifieke binding: moleculen passen precies op andere. Er wordt maar één type eiwit gebonden
Eluens
Verschillende oplosmiddelen kunnen worden gebruikt als mobiele fase. In het geval van adsorptie en verdelingschromatografie is de polariteit van groot belang. De mogelijke oplosmiddelen worden daarom weergegeven als een eluotrope reeks. Dat wil zeggen een reeks die stapsgewijze steeds sterker polair wordt. De reeks loopt van hexaan (apolair) tot methanol (polair) of zelfs water (zeer polair). De oplosmiddelen kunnen worden gemengd. Ook geleidelijk tijdens de elutie: gradiëntelutie.
- Het eluens moet vrij van deeltjes zijn en wordt daarom gefiltreerd (inlaat met filter).
- Het eluens moet vrij van opgeloste lucht zijn en wordt daarom tevoren ontgast.
Bij HPLC (adsorptie en verdeling) verdringt het eluens de componenten van de stationaire fase. Is het eluens minder polair dan de stationaire fase, dan noemen we dit "normal phase". Als stationaire fase gebruik je silica of een gebonden polaire fase zoals aminogroepen of OH-groepen. Is het eluens meer polair dan de stationaire fase dan is dit "reversed phase". De stationaire fase is dan een apolaire stof op de silicadrager (of kunststofdrager). De actieve groepen zijn C8, C18, phenyl of cyanogroepen.
Injector
De injectie van het monster gebeurt bij HPLC door een "sample loop". Dat wil zeggen: je schakelt een vast volume monstervloeistof in de lopende mobiele fase. Dit is steeds een even groot volume. Het voordeel is dat bij hplc externe standaarden mogelijk zijn. Je kunt dus een ijklijn (kalibratiecurve) maken voor een bepaalde component. Animatie sample loop.
Kolom
De kolom is bij HPLC een stevige stalen buis met hierin heel fijn verdeeld materiaal. De kolom is meestal niet langer dan 20 á 30 cm. Kolommen worden met de gewenste inhoud: korrelgrootte en stationaire fase, kant en klaar gekocht. Er zijn voor speciale doeleinden ook capillaire kolommen in gebruik. Kolommen worden steeds vaker in een oven of waterbad op temperatuur gehouden.
Detector
- UV De UV-detector is het meest gebruikt. Je meet dan dus de absorptie van de langskomende componenten. Het kan zijn dat je een component "niet ziet" doordat deze niet de gekozen golflengte absorbeert. Dan is de diode-array een oplossing.
- Diode-array Diode array werkt als de uv-detector maar meet in een groter deel van het spectrum.
- Brekingsindex Weinig gevoelig en bij gradiënt elutie niet bruikbaar.
- Fluorescentie Zeer gevoelig voor specifieke stofjes. Maar ja: voor andere stofjes dus minder.
- MS De massaspectrometer. Ook bij HPLC slagen de technici er in om een koppeling met de massaspectrometer tot stand te brengen. Dat is niet zo eenvoudig omdat je de monstercomponenten wilt analyseren en het oplosmiddel kwijt wilt raken. De MS werkt immers in vacuüm!
Veel routineanalyses worden gedaan met twee detectoren. Je kunt dan gebruik maken van specifieke gevoeligheid, bijvoorbeeld met fluorescentie, maar toch ook de andere componenten meten met bijvoorbeeld UV. Bovendien heb je een dubbele meting, wat de uitkomst meer zekerheid geeft.
Voorbeelden van stoffen die met HPLC gemeten worden:
- anorganische ionen
- organische kleurstoffen
- aminozuren
- eiwitten
- suikers
- vetzuren